導讀：

不久前，FDA頒布了指南《Analytical Procedures and MethodsValidation for Drugs and Biologics》的終稿文件，這份關鍵的指南文件，為制藥行業的分析方法驗證提供了技術指導。本文作者為了讓大家更好的理解和掌握此指南，根據工作經驗，解讀如下，一起來看下具體詳情。?

分析方法驗證一直是藥品研發和質量控制的關鍵問題，也是重點問題，一直被制藥行業所關注。在2015年7月份之前，世界各國法規方頒布了一系列的相關指南或者指導原則：?

---中國CDE頒布的《化學藥物質量控制分析方法驗證技術指導原則》；

---2015版藥典附錄XIX A《藥品質量標準分析方法驗證指導原則》；

---ICH Q2《VALIDATION OF ANALYTICALPROCEDURES: TEXT AND METHODOLOGY》；

---FDA指南《Analytical Procedures and Methods17 Validation》

---FDA指南《Guidelines for Submitting Samplesand Analytical Data for Methods Validation》。

在2015年7月，FDA頒布了指南《Analytical Procedures and Methods Validation for Drugs and Biologics》的終稿文件，這份關鍵的指南文件，為制藥行業的分析方法驗證提供了技術指導。為了讓大家更好的理解和掌握此指南，筆者根據工作經驗，解讀如下。

這部指南介紹了很多內容，包括起草背景、法規要求、分析方法的研發、分析方法的內容要求、標準品和試劑的要求、分析方法驗證的要求、統計分析和模型、分析方法的生命周期管理、方法確認的內容。本文選擇關鍵點，為各位介紹這份指南的技術要求。

　　第一部分：分析方法研發的要求

在方法研發的早期，應對方法的耐用性進行評估和研究，因為該屬性可以幫助申請者決定提交哪個方法去獲得批準。研發早期的分析方法是基于對基礎方法學的了解和之前的經驗來建立的。早期程序的實驗數據可以用于指導進一步的研發。如果這些研發數據支持分析方法的驗證的話，申請者應該在方法驗證部分提交相關的研發數據。

為了全面了解分析方法參數變更的影響，申請者應該采用一個系統的方法進行方法耐用性研究（例如設計一個方法參數實驗）。開始申請者應采用風險評估，然后進行多變量實驗。這樣的方法能讓申請者了解參數因子對方法性能的影響。對方法性能評估可以包括分析來自生產工藝中的中控階段到成品階段的樣品。從這些方法變化來源的研究中獲得的知識可以幫助申請者評估方法的性能。

　　第二部分：分析方法的內容要求

在這部分，FDA指南展開介紹了很多內容，依次如下：

　　2.1原理/范圍

需要描述分析測試方法/技術（即分離、檢測）基本原理的情況。還要描述目標分析物和樣品類型（例如原料藥、制劑、雜質或生物液體中的化合物）。

　　2.2儀器/設備

在這部分需要描述所有需要的確認過的儀器和組件（例如儀器類型、檢測器、柱子類型、尺寸和可替代的柱子、過濾器類型）。

　　2.3運行參數

需要提供確認過的優化的參數設置和范圍（包括來自藥典或研發和/或驗證研究的允許調整），對于分析過程非常關鍵（例如流速、部件溫度、運行時間、檢測器設置、梯度、頂空進樣器）。適當時，可以使用經驗參數設置和積分參數的樣圖來作為補充。

　　2.4試劑

在這部分需要提供：

1. ---試劑或標準的描述
2. ---化學品的級別（例如，USP/NF，美國化學協會，HPLC色譜級，或GC色譜級或無防腐劑的）
3. ---來源（例如USP標準品，內部確認的對照物質，WHO國際標準/對照物質，CBER標準）
4. ---純度（只有純的化學品需要）、狀態（例如干品，未干燥品）和濃度
5. ---效價（CFR，USP所要求）
6. ---存貯條件
7. ---安全使用指示（以現行MSDS為準）
8. ---驗證過的或書面確認的貨架儲存期
9. ---生物試劑的新批號，例如，單克隆抗體、多克隆抗原、或細胞，可能需要包括進一步確認程序，作為分析方法的一部分。

2.5樣品制備

各供試樣品的制備程序（例如提取方法、稀釋或濃縮、除鹽和超聲混合、震搖或超聲時間）。供試樣定性單樣配制方法，定量測試平行樣品配制方法，工作溶液適當的濃度單位（例如μg/ml或mg/ml），以及溶液的穩定性和存貯條件的信息。

2.6標準控制溶液制備

所有標準溶液和控制溶液的制備和使用程序。需要注明適當的濃度單位，有標準穩定性信息和存貯條件，包括校正標準、內部標準、系統適用性標準等。

2.7檢驗程序

對方法的逐步描述（例如平衡時間，掃描/進針序列，空白，基底樣，樣品，控制樣，敏感溶液（雜質方法）和在分析過程中維持系統適用有效性的標準樣）以及允許運行范圍和適當時的調整。

2.8系統適應性

對測試程序和參數進行確證以保證系統（儀器、數據工作站和分析操作要點和分析的控制點）能在使用時作為一個整體正確運行。適用于對照控制和樣品的系統適用性的可接受標準，如拖尾因子、精密度和分辨率可接受標準，在適當時可以進行要求。色譜系統的系統適用性，參見FDA行業指南《色譜方法的驗證》和USP通論<621>色譜。

2.9計算

根據標識聲明和質量標準（例如含量、特定和非特定雜質和相對響應因子）進行測試所得的數據分析（標準、控制、樣品）中所用的積分方法和代表性計算公式。其中應包括數據分析中所使用的所有數學變換或公式的描述，以及使用的所有修正因子的科學論證。

2.10數據的報告

與儀器的能力和可接受標準相一致的數字式數據的表現方式。方法中應指明要采用何種格式來報告結果（例如標識聲明的百分比，重量/重量，重量/體積），并指定所需報告的有效位數。美國材料試驗協會（ASTM）E29標準中描述了在測試數據中使用有效位數來決定與質量標準符合性的標準規范。如果是色譜方法，申請者應該包括保留時間（RT）用于與標準品比較，相對保留時間（RRT）（已知和未知雜質）可接受范圍和樣品結果報告標準。

第三部分：標準品和試劑的要求

基準標準品和二級標準品和物質在ICH指南中已有定義和討論：Q6B《質量標準：生物技術/生物制品檢驗方法和可接受標準》和Q7《原料藥GMP指南》。申請者要確保所有的標準品均適合于其目的用途。申請者要嚴格遵守標準品存貯和使用條件及處理指令，避免改動和污染，這可能會導致另外的雜質和分析不準確。申請者應該在申報資料中包括各標準品和物質適合于其用途的支持信息。適當時，支持標準品和物質的信息應包括確認試驗報告和檢驗報告（包括穩定性試驗方案、報告、相關已知雜質概況資料）。對于BLA下的生物制品，要在年報中包括之后的標準品批次的確認。

標準品通常可以從USP處獲得，也可以通過EP、JP、WHO或國際標準技術委員會獲得。大量的生物產品標準品也可以從CBER處獲得。在美國上市的特定生物制品，CBER授權的標準品必須在產品放行上市前使用。從其它來源獲得的對照物質應根據程序進行確證，包括常規測試和ICH Q6B里所述的超出常規放行測試的項目。申請者應考慮矩陣方法來確證標準品。附加測試可以包括確定標準品的適用性，這可能在原料藥或藥品放行測試中發現不了（例如更全面的結構確證和效價、純度和雜質矩陣技術）。

新的標準品（官方的或自制的）要采用現行的標準品進行確認/校正。對于生物制品標準品和物質，FDA建議申請者在確認新的標準品時采用雙軌方法，以防止質量屬性的漂移。雙軌方法是將每個新的標準品與基準標準品進行比較，這樣將其與臨床試驗物質和現行生產工藝相關聯。

第四部分：分析方法驗證的要求

4.1非藥典分析方法

分析方法驗證是證明一個分析方法適合于其既定用途的過程。方法學和分析方法的目的應在開始驗證研究之前進行清楚的界定和了解。這種了解是來自于基于科學的方法研發和優化研究。驗證數據必須是從申請者按GMP規范批準的方案中產生，方案中要有每個驗證項目的方法學描述，并確定和論述可接受標準，采用經過確認的儀器實施驗證。應起草并實施原料藥和制劑分析物或對應基質的分析混合物的驗證方案。申請者應該在申報資料中包括驗證研究及結果的詳細內容。

4.2驗證屬性項目

盡管并不是所有的驗證屬性適用于所有類型的測試，但一般的驗證屬性包括：

1. Specificity 專屬性
2. Linearity 線性
3. Accuracy 準確度
4. Precision (repeatability, intermediate precision, andreproducibility)精密度（重復性、中間精密度和再現性）
5. Range 范圍
6. Quantitation limit 定量限
7. Detection limit 檢出限

如果一個方法是經過驗證的定量分析方法，可以檢出原料藥和制劑在存貯期間的質量屬性的變化，則認為該方法是具有穩定性指示性的測試方法。為了證明一個穩定性指示檢驗方法的專屬性，要進行一系列的挑戰。一些挑戰包括向樣品中加入目標分析物和所有已知的干擾物、經過不同化驗室強降解試驗的樣品、實際藥品的樣品（通過最終生產工藝生產出）經過長期放置或在加速溫濕度條件下存貯。

4.3藥典分析方法

一個分析方法（例如USP/NF，AOAC國際的官方分析方法，或其它公認的標準對照）的適用性應在實際使用條件下經過確認。證明USP/NF分析方法適用于原料藥或制劑的資料應包括在申報資料里，并且是從確認方案中產生的。

確認方案應包括，但不僅限于（1）要確認的藥典方法，預定的可接受標準，（2）方法學的詳細說明（例如試劑、設備、配件、色譜條件、色譜柱、檢測器類型、檢測器信號響應靈敏度、系統適用性、樣品制備和其穩定性）。該方法和確認程度應決定要包括在方案中的驗證項目測試（例如專屬性、LOD、LOQ、精密度、準確度）。在決定方案中應包括哪些驗證項目時的考慮取決于一些具體情況，如質量標準限度設定是否嚴于藥典可接受標準，或RT或RRT概況由于原料藥合成路線、生產工藝或制劑基底不同而在色譜方法中有所變化。如果完全按照藥典方法實施，沒有偏差的話，藥典含量方法不需要進行耐用性研究。

　第五部分：分析方法生命周期內的管理

分析方法（包括藥典方法）被成功驗證（或確認）和實施后，在其產品的生命周期中應遵守該方法，以持續保證方法保持適合其既定用途。應定期對方法表現進行趨勢分析，評估是否需要對分析方法進行優化，或對全面或部分分析方法進行再驗證。如果一個分析方法只能通過不斷調整分析方法里載明的運行參數來符合所建立的系統適用性要求，則應對該分析方法進行再評估、再驗證，適當時進行修正。

在一個產品的整個生命周期中，新的資料和風險評估（例如對產品CQA有更好的了解，或發現新的雜質）可能會保證一個新的或替代的分析方法的研發和驗證。新技術可能會帶來產品質量保證方面更多的了解和/或可信度。申報者應定期評估產品分析方法的適當性，考慮新的或可替代的方法。

預計在生命周期中會對分析方法進行變更，因此要保留適當數據量的留樣進行對比研究。樣品數量應基于科學原理以及風險評估。對生產工藝較為敏感的復雜產品，其留樣可能是做對比研究的重要工具。

用于對比研究的留樣應包括代表上市藥品的樣品，如可能，還應包括關鍵的臨床試驗物料。

如果基于風險的評估或其它原因導致對分析方法進行變更，或采取新的方法取代舊的方法，或分析方法轉移至一個新的檢測場所，則要考慮進行再驗證、新的驗證、分析方法對比研究或聯合進行這些工作。在有些情形下，對原料藥或藥品生產工藝的變更也會導致分析方法再驗證。這些額外的研究討論如下：

5.1再驗證

在前面分析方法驗證部分所述原則適用于再驗證。如果對一個分析方法進行了變更（例如對設備有變更，或試劑的變更，或因為生產工藝或配方有變更），則可能要考慮對分析方法進行全部或部分再驗證。在和平工藝變更時可能也需要對分析方法進行再驗證，例如可能影響分析方法性能的原料藥生產工藝變更（例如合成路線、發酵）或引入新的制劑配方。

申請者要進行再驗證以保證分析方法維持其關鍵性能指標（例如專屬性、精密度、準確性）。再驗證的程度取決于變更的性質。

5.2分析方法對比研究

分析方法對比研究要求一般是在申請者提議采用一個替代分析方法取代一個FDA批準的分析方法時，或將一個分析方法從一個實驗室轉移至另一個實驗室時產生的。用于決定兩個分析方法的等同性的統計學方法信息，需要引用適當的文獻或文件。這些情況討論如下：

5.2.1可替代的分析方法

替代性分析方法是申請者用來代替FDA已經批準的分析方法的一種分析方法。對于一個NDA或ANDA，申請者要將所有擬定的替代分析方法包括在申報資料中。申請者必須包括方法描述。在批準后，對于一個NDA或ANDA，或在BLA里批準但未包括在FDA法規里的分析方法，凡增加、修改或刪除替代分析方法均要在下一次年報中記載。

對于生物制品，FDA法規里可能很少包括分析方法。如果所需的分析方法在法規里進行了描述，但申請者想使用一個方法來替代，申請者必須根據21 CFR 610.9(a)提交替代方法供審核和批準。申請者必須提交證據"……證明方法修訂能確保生物制品的安全、純度、效價和有效性等同或優于生物制品通用標準或附加標準中給出的方法或程序"。對這樣程序的修訂需要在申報資料評估過程中或在批準后增補中獲得FDA批準。

申請者要分辨可替代性分析方法的使用（例如放行檢測、穩定性測試），提供其內容的合理性論證、驗證數據和與FDA批準的分析方法的對比數據。申請者要進行分析方法對比研究，至少證明：

1. ---新的方法配備了另外的控制手段，在其既定用途上等同或超過原始方法
2. ---新的分析方法比原始方法更不易受到基質的影響

如果采用新的檢驗方法能發同新的與工藝雜質或產品變化產生的雜質或所有新的雜質，則應對歷史批準的留樣進行檢查，證實新方法檢出的變化/雜質是因為新的方法靈敏度或選擇性增加的結果，而不是工藝雜質變化的結果。

如果分析方法具有穩定性指示特性：

1. ---應包括適當的樣品，比較新的方法和原始方法檢出相關產品變化和降解物的能力；
2. ---對比時所分析的批次數應能提供足夠的統計性能；
3. ---要采用適當的統計學方法來實施等同性、不低于或優越性研究，來證明新方法或修訂過的方法的性能等同或優于原始方法；
4. ---要識別出用于比較產品檢測結果的統計學分析方法；
5. ---適當時，分析方法間所有觀察到的偏差或差異以及對比結果均應進行討論，并提出解釋。

5.2.2分析方法轉移研究

分析方法轉移一般要使用轉移方案進行管理，在方案中詳細寫明要評估的參數，以及適用于結果的預定可接受標準。轉移研究通常包括兩個或更多化驗室或場所（轉出化驗室和接收化驗室），由其實施預先批準的轉移方案。轉出化驗室和接收化驗室使用具有代表性的足夠數量的測試物（例如相同批號的原料藥或制劑）。實施對比研究是為了評估準確度和精密度，特別是實驗室之間的差異。如果所轉移的分析方法也是穩定性指示性方法，則應在兩個化驗室均對強降解樣品或含有所要檢測的相關雜質的樣品進行檢測。USP通論<1224>"分析方法轉移"提供了關于此問題的更多指南。

　綜述

　　從上面的介紹來看，FDA最新分析方法驗證指南具有如下特點：

• 第一、 更重視方法開發的作用。根據QBD的理念，好的分析方法一定是開發出來的，而不僅僅是驗證的結果。
• 第二、 分析方法的描述必須全面，在指南的分析方法內容要求部分，詳細介紹了分析方法應該含有的技術內容。這和國內很多企業分析規程只包括項目和限度的做法，是明顯不同的。一個只包括項目和限度的分析規程，是不完整的，不能體現分析方法的全貌。
• 第三、 分析方法必須實施生命周期內的管理，如果出現各類變更，應該及時進行再驗證。
• 第四、 FDA介紹了分析方法對比的要求的分析方法轉移的要求，這都是國內指導原則的不足之處，可以起到補充作用。